近期一项由日本研发人员发表的题为《在硅酮弹性体材料的微图纹明胶上成纤维细胞的拉伸》备受关注, 该实验采用含有叠氮苯基的光反应明胶对硅酮弹性体(SEs)表面进行改性，制备叠氮苯胺偶联和叠氮苯甲酸偶联两种明胶，硅橡胶表面经过等离子处理，然后用掩膜在材料表面进行刻划明胶，表面润湿性通过这些处理得到调节。 用反射共聚焦激光显微镜测量明胶层厚度，明胶厚度受明胶用量的调节。 通过将明胶固定在表面，细胞粘附性显著增强，这种增强与改性明胶的类型有关。通过条状固定处理可调节细胞与硅酮粘接后的形态，并可获得较高的展向伸长。 虽然均匀固定化的明胶与未固定化表面具有相同的成纤维细胞抵抗拉伸应力的倾向(垂直方向)，但微图纹明胶通过拉伸应力抵抗了这种变形。 显微观察表明，细胞骨架纤维形成，有方向性，能抵抗机械应力的改变，但细胞骨架有一定的重组。 本研究表明，细胞骨架纤维的形成和取向对机械应力的响应具有重要意义。

硅酮弹性体(SEs)作为常见的生物植入材料已被广泛应用 它们是一种弹性弹性体，具有许多独特的整体性能，如高光学透明度、高耐热性、极低的溶解度参数和高的气体渗透性。 此外，它们还具有其他表面特性，如低表面自由能、无毒和生物相容性。本次实验采用日本STREX公司提供的硅酮弹性体(SEs)拉伸室进行实验，在本研究中，我们在硒表面制备了微图案明胶，并研究了机械应力对其表面粘附细胞的影响。 对于共价微图案的固定，采用光固定的方法对se24,25细胞进行固定，微图案使细胞排列、细胞形状的调节和细胞抵抗机械应力。

图1： (A)明胶的合成方案和化学结构展示了两种(a) AA明胶-和(b) AB明胶的合成过程。 (B) 光化固定过程的示意图说明SE材料表面:(i)等离子处理SE材料表面,(ii) 滴涂法-光反应处来实现添加明胶溶液和干燥,(iii) 两种类型表面处理，没有(e)和有紫外光照射下光掩模处理(f), (iv)洗涤去除自由明胶,(v)灭菌。 明胶-明胶(c)和明胶- SE表面(d)交联。(C)拉伸实验示意图。 (vi)细胞在不拉伸的固定化SE室中接种24 小时。 (vii)在拉伸条件下，通过手动旋转旋钮使膜膨胀，额外培养24 小时细胞。 将拉伸装置(g)装在到SE拉伸室(h)。

关于SE材料制备本文省略（如需要可联系翻译者BioGuider），仅介绍SE薄膜表面处理，

在本次拉伸实验中, 使用了商用的日本STREX公司生产的的4cm²标准拉伸室。 按照图1B所示的程序对SE拉伸室膜表面进行处理。 氧等离子处理后SE膜表面亲水化(100W, 5%氧化,10s)。AB明胶或AA明胶通过滴涂法 (40毫升)和紫外线照射点光源从5厘米的距离照射10秒。 在2毫米厚的掩膜存在下，照射时间可延长至360秒。 样品用在20(体积0.1%mL mL-1)洗涤至少三次，最后用37℃蒸馏水彻底冲洗。 细胞培养实验前，在干燥条件下静置1天。在乙醇中浸泡灭菌15分钟至少三次，在灭菌的磷酸盐缓冲盐水中冲洗三次。

大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F细胞)在磷酸盐缓冲液片剂改良的最低基本培养基中保持在低于5% CO2的37℃水平，该培养基含有高水平的葡萄糖、l -谷氨酰胺和酚红，并添加1%青霉素和10%胎牛血清。 在混合后，收集细胞并在同一培养基中进行再次培养。

初始细胞粘附的研究是通过接种每毫升8.0x105个细胞在经过亲水处理的SE膜表面培养，24格(n = 3) 30分钟。下列实验,每毫升1.0x105个细胞将被接种培养24 h。相同的数量的细胞将用于拉伸实验。 培养24小时后，在暴露环境中情况下进行24小时的拉伸测试。为了进行染色实验，细胞用PBS缓冲液洗涤三次，并在多聚甲醛(4%)中固定。 用四甲基罗丹明环肽偶联物荧光染色法检测细胞骨架。 荧光显微镜(Olympus IX71)检测荧光强度。 通过光学显微镜观察细胞数量、细胞面积和延伸率，并借助Fij进行免疫组化图片分析。

本拉伸实验中，选购了日本STREX公司的手动细胞拉器。 拉伸实验的示意图如图1C所示。 拉伸实验在静态条件下进行24 h，拉伸力释放后采集图像。 施加的力百分比是通过扩展距离除以腔室面积(20 mm)乘以100来计算的。

所有的图像和数据都代表了至少四项独立的生物实验的结果， 误差条由标准偏差给出。 采用Microsoft Excel软件统计学比较进行配对T-test样本（双尾）数据分析。

(a) 接种 30 分钟后，附着在 AA-明胶 1-、AA-明胶 2-、AB-明胶 3-和 AB-明胶 4 涂层的 SE 膜上的细胞数。 Y 轴是每个样本（20} 透镜）不同点的五个图像中计数的细胞的平均值。 (b-e) (b) 和 (c) AA-明胶 1 和 (d) 和 (e) AB-明胶 4 的鬼笔环肽染色细胞的荧光显微镜图像。(n = 3,mean} SD)。

（a-c）（a）和（c）完全明胶涂层表面和（b）和（d）图案化明胶涂层表面上细胞的光学显微镜图像。 (e) 孵育 24 小时后测量的细胞面积和长度（n = 100 个细胞，平均值SD）。

用鬼笔环肽在涂有明胶的 SE 薄膜上染色的细胞骨架（a）无图案且无拉伸，（b）无图案且有拉伸，（c）有图案且无拉伸，以及（d）水平且（ e) 垂直模式与拉伸相结合。

细胞功能和活性受底物特征（几何和形貌）和机械刺激（例如拉伸和流体剪切）的综合作用调节。 构建了一个理论反应-扩散模型，该模型在足细胞，表现出形状主导的表型，和成纤维细胞，表现出张力主导的表型。 众所周知，一些细胞类型在二维培养中垂直于施加的循环拉伸，但在三维培养中平行于拉伸。报道了应力纤维动力学的计算模型，包括软凝胶中牵引边界条件和改变的应变传递的影响。物理和生物参数对于理解细胞功能都很重要。最近，据报道，单层细胞的形状会受到其相邻细胞的影响。本研究中的图案化和拉伸效应是使用分离的细胞进行的。需要进一步的实验来评估浓缩细胞群在图案化和拉伸下的行为，这更接近于体内自然条件。

翻 译： BioGuider

本文仅为部分节选内容，引自： J. Mater. Chem. B, 2020, 8,416，收录时间2019年11月30日

原文标题："Stretching of fibroblast cells on micropatterned gelatin on silicone elastomer"

作 者：Stefan Muller Motoki Ueda,Takashi Isoshima,Takashi Ushida and Yoshihiro Ito